앞 장에서 우리는 Perturb-seq가 어떻게 한 번에 하나씩이라는 유전자 기능 연구의 오랜 한계를 깨뜨렸는지 살펴보았다. 그런데 Tian et al. (2021) 연구가 아무리 혁신적이었다 해도, 그것은 2차원 평판 배양(2D culture)에서 얻은 뉴런이었다. Ngn2 유도 뉴런 시스템은 균일하고 대규모 생산이 가능하다는 장점이 있지만, 그 대가로 극도로 단순화된 세포 환경을 감수해야 했다. 실제 뇌에서 뉴런은 절대 혼자 살지 않는다. 성상세포(astrocyte)가 옆에서 영양을 공급하고, 미세아교세포(microglia)가 감시하며, 다른 뉴런들과 수백 개의 시냅스로 연결되어 끊임없는 전기 신호의 교환 속에 존재한다. 세포의 운명은 이런 맥락 속에서 결정된다. 특정 유전자를 교란했을 때 나타나는 효과도, 세포가 처한 환경에 따라 전혀 다를 수 있다. 농구 선수의 실력을 평가할 때 빈 체육관에서 슛 연습만 시키는 것과, 실제 경기 중에 관찰하는 것이 전혀 다른 결과를 주는 것처럼, 세포도 고립된 환경과 복잡한 조직 안에서 다르게 행동한다. 2차원 배양에서는 보이지 않지만 실제 발달하는 뇌 조직에서는 결정적인 효과를 내는 유전자 기능이 분명히 존재할 것이다. 2023년에 발표된 일련의 연구들은 이 한계를 넘어서는 도전을 시작했다.
뇌 오가노이드(brain organoid)는 인간 줄기세포를 3차원으로 배양하여 실제 발달 중인 뇌와 유사한 구조를 만들어낸 조직이다. 2013년 매들린 랭커스터(Madeline Lancaster)와 요르크 크노블리히(Jürg Knoblich)가 처음 개발한 이후로, 뇌 오가노이드는 빠르게 신경발달 연구의 핵심 모델이 되었다. 피질 방사 글리아(cortical radial glia), 중간 전구세포(intermediate progenitor cell), 흥분성 뉴런과 억제성 뉴런이 공존하는 3차원 구조 안에서, 각 세포는 서로의 신호를 받으며 발달한다. 인간 특이적 세포 유형인 oRG 세포도 나타나고, 피질 층판화(cortical lamination)의 초기 단계도 관찰된다. 그러나 오가노이드에서 Perturb-seq를 수행하는 것은 2차원 배양에서보다 훨씬 어렵다. 세포들이 덩어리 안에 묶혀 있어 바이러스를 균일하게 전달하기 어렵고, 각 세포가 오가노이드 내에서 어느 위치에 있었는지에 따라 완전히 다른 환경에 노출되었을 수 있으며, 오가노이드마다 발달 상태가 다를 수 있다는 배치 효과(batch effect)도 문제다.
2023년 Nature에 발표된 CHOOSE(CRISPR-Human Organoids-scRNA-Seq) 플랫폼은 이 도전에 정면으로 맞섰다. 이 연구의 핵심 전략은 오가노이드가 만들어지기 전 단계, 즉 iPSC 단계에서 CRISPR 교란을 도입하는 것이었다. 유도성 향상 특이적 Cas9(inducible enhanced-specificity Cas9, eCas9)이 삽입된 인간 배아줄기세포 주에, 4-하이드록시타목시펜(4-hydroxytamoxifen)에 의해 활성화되는 CRE 재조합효소를 도입했다. 이 설계에서 Cas9은 CRE가 활성화될 때까지 loxP-stop 카세트에 의해 차단된 상태로 있다가, 원하는 시점에 타목시펜을 처리하면 비로소 활성화된다. 따라서 연구자는 CRISPR 교란이 일어나는 발달의 시점을 정밀하게 제어할 수 있다. 교란이 일어난 세포들은 오가노이드가 형성되는 과정에서 교란되지 않은 세포들과 함께 존재하여 모자이크(mosaic) 오가노이드를 형성하고, 이것이 내부 대조군이 된다. 각 표적 유전자에 대해 두 개의 gRNA를 동시에 사용하는 이중 gRNA 설계는 두 가닥 모두 효율적으로 편집될 가능성을 높여 완전한 기능 상실을 보장했다.
스크리닝 대상은 전사 조절(transcriptional regulation)과 연관된 36개의 고위험 자폐스펙트럼장애 유전자들이었다. 스크린의 결과는 세포 생존율이 아니라 scRNA-seq를 통한 세포 구성 변화(cell composition change)였다는 점이 중요하다. 어떤 유전자를 교란했을 때 특정 세포 유형이 더 많아지거나 줄어드는가, 즉 세포 운명 결정(cell fate decision)에 어떤 영향을 미치는가를 읽어낸 것이다. 가장 강력한 표현형을 보인 유전자는 ARID1B였다. BAF 크로마틴 리모델링 복합체(BAF chromatin remodeling complex)의 핵심 구성 성분인 ARID1B는 자폐스펙트럼장애의 고위험 유전자 중 하나인데, 이 유전자를 교란했을 때 복측 방사 글리아(ventral radial glia)가 비정상적으로 늘어나고 희소돌기세포 전구세포(oligodendrocyte precursor cell) 및 초기 인터뉴런 전구 세포로의 전환이 증가하는 것이 관찰되었다. 등쪽 피질 뉴런, 특히 상층 흥분성 뉴런으로의 분화가 억제되고, 대신 복측 운명으로 치우치는 현상이었다. 이것은 기존의 2차원 배양에서는 명확하게 포착하기 어려운 발달적 표현형이었다. 오가노이드가 3차원 구조 속에서 등쪽과 복쪽 텔렌세팔론(telencephalon)의 세포들을 모두 포함하기 때문에, 그 경계에서 일어나는 운명 전환을 관찰할 수 있었던 것이다. 또한 BAF 복합체 전반에 걸쳐 비슷한 방향의 표현형이 나타났는데, 이는 ASD 유전자들이 단순히 흩어진 개별 기능을 하는 것이 아니라, 특정 분자 복합체나 경로를 통해 공통된 발달 메커니즘에 수렴한다는 것을 직접적으로 보여주었다.
오가노이드가 3차원 구조라는 점에서는 진일보했지만, 단일 뇌 영역의 오가노이드는 여전히 실제 뇌의 중요한 특성 하나를 재현하지 못한다. 서로 다른 뇌 영역 사이의 세포 이동(cell migration)이다. 대뇌 피질의 억제성 인터뉴런(inhibitory interneuron)은 피질에서 태어나지 않는다. 이 세포들은 뇌의 복쪽 부분인 내측 신경절 융기(medial ganglionic eminence, MGE)에서 태어나, 멀리 있는 피질까지 긴 여정을 이동하여 흥분성 뉴런들 사이에 자리를 잡는다. 이 이동 과정에 문제가 생기면 흥분성/억제성 불균형(E/I imbalance)이 발생하고, 이것이 자폐스펙트럼장애를 비롯한 여러 신경발달장애와 연관된다는 가설이 있다. 단일 오가노이드에서는 이 이동을 재현할 수 없다. 이동의 출발지와 도착지가 분리된 구조가 필요하다.
어셈블로이드(assembloid)는 이 문제에 대한 해법이다. 서로 다른 뇌 영역을 모방한 두 개의 오가노이드를 각각 만든 다음, 물리적으로 붙여놓으면 경계를 따라 융합이 일어나고, 한쪽에서 만들어진 세포들이 다른 쪽으로 이동하는 것을 관찰할 수 있다. 2023년 Nature에 발표된 스탠퍼드 대학교 Pașca 연구실의 연구는 이 어셈블로이드 시스템에서 CRISPR 스크리닝을 수행한 최초의 대규모 연구였다. 연구진은 인간 복측 전뇌 오가노이드(human subpallial organoid, hSO)와 피질 오가노이드(human cortical organoid, hCO)를 융합한 인간 전뇌 어셈블로이드(human forebrain assembloid, hFA)를 사용했다. hSO에는 Dlxi1/2b::eGFP 리포터가 삽입되어 있어, MGE 계통의 인터뉴런 전구세포들이 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현한다. 어셈블로이드가 형성되면, GFP 양성 세포들이 hSO에서 hCO로 이동하는 것을 시각적으로 추적할 수 있었다.
연구진은 총 611개의 자폐스펙트럼장애/신경발달장애 연관 유전자 목록을 작성하고, 이 중 복측 전뇌/인터뉴런 집단에서 실제로 발현되는 425개를 추려 스크리닝 대상으로 삼았다. 스크린은 두 단계로 나뉘었다. 첫 번째는 인터뉴런 생성(interneuron generation) 단계로, hSO에서 GFP 양성 대 GFP 음성 세포 비율이 어떻게 변하는지를 측정했다. 두 번째는 인터뉴런 이주(interneuron migration) 단계로, hFA에서 인터뉴런이 피질 구획으로 얼마나 이동했는지를 1,000개가 넘는 어셈블로이드에서 정량화했다. 두 단계를 분리한 것이 이 연구의 가장 영리한 설계였다. 어떤 유전자는 인터뉴런 생성 자체를 줄이고, 어떤 유전자는 인터뉴런은 정상적으로 만들어지지만 이동을 못 하게 한다. 두 가지는 표현형이 비슷해 보여도 전혀 다른 메커니즘이고, 두 스크린을 분리해야만 구분할 수 있다. 생성 스크린에서 13개, 이주 스크린에서 33개의 후보 유전자가 확인되었다.
이주 스크린에서 가장 흥미로운 발견은 LNPK(루나파크, Lunapark)였다. 이 유전자는 소포체(endoplasmic reticulum)의 형태를 유지하는 데 관여하는 단백질로, 신경발달장애와의 연관성은 알려져 있었지만 정확히 어떤 메커니즘으로 관여하는지는 미스터리였다. 연구진이 이주 과정을 실시간으로 촬영해보니, 인터뉴런이 이동할 때 핵(nucleus)이 앞으로 밀려오기 전에, 소포체가 먼저 세포의 앞쪽 돌기로 이동하는 것이 관찰되었다. 소포체의 이 선제적 이동이 없으면 핵 이동이 일어나지 않는다는 것이었다. LNPK가 없으면 소포체가 제대로 앞쪽으로 이동하지 못하고, 결과적으로 인터뉴런 이주 전체가 실패했다. 세포 소기관의 배치(organelle positioning)가 신경 이주(neuronal migration)를 선행하는 물리적 사건이라는, 이전에는 알려지지 않았던 세포 생물학적 원리가 유전체 규모 스크린에서 우연히 발견된 셈이다.
한 가지 더 주목해야 할 것은 세포 자율적(cell-autonomous) 효과와 세포 비자율적(non-cell-autonomous) 효과를 분리할 수 있다는 점이다. 세포 자율적 효과란, 유전자 교란의 결과가 그 유전자가 망가진 세포 자체에서만 나타나는 것을 말한다. 쉽게 말해 “내 문제는 나만의 문제”인 경우다. 세포 비자율적 효과는 “내 문제가 옆집 문제도 된다”는 것이다. 예를 들어 LNPK 유전자가 망가진 인터뉴런은 스스로 이주하지 못하지만, 바로 옆에 있는 정상 인터뉴런은 멀쩡하게 이주한다면, 이것은 세포 자율적 효과다. 반면 세포 비자율적 효과는 이와 다르다. 어떤 세포의 유전자가 망가졌을 때, 그 세포가 분비하는 신호 물질이나 표면 단백질의 변화를 통해 주변의 정상 세포까지 영향을 받는 경우다. 모자이크 어셈블로이드 시스템에서는 교란된 세포와 교란되지 않은 세포가 같은 조직 안에 함께 존재하기 때문에, 이 두 가지를 직접 비교할 수 있다. 교란된 세포만 이상을 보이고 옆의 정상 세포는 멀쩡하다면 세포 자율적이고, 정상 세포까지 함께 이상을 보인다면 세포 비자율적이다. 이 구분은 단순한 학술적 분류가 아니다. 예를 들어 신경퇴행성 질환에서, 만약 어떤 질환 유전자의 효과가 세포 자율적이라면 유전 변이를 가진 뉴런만 교정하면 되지만, 비자율적이라면 그 뉴런이 보내는 잘못된 신호가 주변 회로 전체를 교란하고 있으므로 치료 전략이 근본적으로 달라져야 한다. 실제 신경 회로에서 유전 변이의 병리적 메커니즘을 이해하는 데 이것은 핵심적인 정보다.
오가노이드는 인간 세포라는 장점이 있지만, 실제 뇌의 혈관, 면역 세포, 수초화(myelination), 장거리 신경 회로 같은 요소들을 재현하지 못한다. 오가노이드에서 발견된 표현형이 살아있는 뇌에서도 동일하게 나타나는지는 항상 검증이 필요한 질문이다. 그렇다면 궁극의 실험, 살아있는 뇌 전체에서 수천 개의 유전자를 동시에 교란하고 그 결과를 읽어내는 것은 가능할까?
Shi et al. (2026) 연구는 그 질문에 예스라고 답했다. 이 연구는 카스9(Cas9) 유전자가 이미 삽입된 유전자조작 마우스에 아데노 연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV)로 포장된 gRNA 라이브러리를 뇌에 직접 주사하는 방식을 사용했다. AAV는 신경 조직에 효율적으로 감염되는 바이러스 벡터로, 이것을 통해 1,947개의 질환 연관 유전자를 표적으로 하는 gRNA들을 뇌 전체에 광범위하게 전달할 수 있었다. 생후 16일 된 마우스(P16)에 주사하고 약 3주 후인 생후 45일(P45)에 뇌를 적출하여, 단일핵 RNA 시퀀싱(single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq)으로 분석했다. 분석에 사용된 세포 수가 무려 772만 개였고, 34개의 신경 세포 분류군과 331개의 세부 유형에 걸쳐 각 교란의 효과를 측정했다. 한 번의 실험으로 뇌 전체의 기능 지형도를 그린 것이다.
가장 인상적인 발견 중 하나는 유전적 필수성(genetic essentiality)의 세포 유형 특이성이었다. 어떤 유전자를 교란했을 때 특정 세포 유형에서만 세포가 고갈(depletion)되는 현상이 관찰되었다. 분열하지 않는 성숙한 뉴런에서 세포 고갈은 세포 사멸을 의미한다. 중뇌 글루타민산성 뉴런과 시상 뉴런이 유전 교란에 가장 취약한 집단이었다. 유전자마다 그 유전자에 의존하는 세포 유형의 패턴이 달랐다. 어떤 유전자는 뇌 전체에 걸쳐 광범위하게 필수적이었고, 어떤 유전자는 특정 세포 유형에서만 필수적이었다. 이 세포 유형 특이적 필수성은 신경퇴행성 질환에서 왜 특정 세포 집단이 선택적으로 죽어가는지를 설명하는 중요한 단서가 된다.
또한 교란들의 전사체 효과가 무작위적으로 분산되지 않고, 체계적인 모듈 구조를 이루는 것이 발견되었다. 1,947개의 교란에서 나온 전사 반응 프로파일을 군집 분석(clustering analysis)하면 다섯 개의 주요 모듈이 나타났다. 단백질 항상성/미토콘드리아 기능, 소포체/엔도솜 수송, RNA 스플라이싱, 크로마틴 리모델링, 시냅스 신호전달이 그것이다. 서로 다른 유전자를 교란해도 같은 모듈에 속하는 교란들은 유사한 전사 프로파일을 보였다. 마치 오케스트라에서 바이올린 연주자가 빠지든 비올라 연주자가 빠지든 “현악기 파트 문제”라는 같은 결과가 나오는 것처럼, 같은 생물학적 경로 위에 있는 유전자들은 망가졌을 때 비슷한 세포 반응을 낸다. 이것은 뉴런의 전사 반응 공간이 수천 개의 독립적인 방향이 아니라, 몇 개의 핵심 생물학적 프로그램 축을 따라 조직된다는 것을 의미한다.
가장 눈길을 끈 발견은 Grin2a와 Grin2b라는 두 NMDA 수용체 서브유닛의 대조적인 효과였다. 이 두 유전자는 매우 유사한 단백질을 만들고 같은 수용체 복합체의 구성 성분이지만, 질환 연관성은 반대 방향이다. Grin2a는 조현병(schizophrenia)과 연관되고, Grin2b는 자폐스펙트럼장애 및 조기 발병 신경발달장애와 연관된다. Shi et al. (2026)의 데이터에서, 2/3층 피질 뉴런에서 Grin2a를 제거했을 때와 Grin2b를 제거했을 때의 전사 반응은 거의 반대 방향이었다(피어슨 상관계수 R = -0.516). Grin2a 결실은 활동 의존적 가소성 유전자들(Bdnf, Nptx2, Rgs2)을 활성화하는 방향으로 반응했고, Grin2b 결실은 구조적 재형성 유전자들(Stmn1, Celsr2, Adamts2)을 활성화했다. 두 유전자가 같은 복합체의 구성 성분임에도 세포 내에서 반대 방향의 역할을 한다는 것, 그리고 바로 그것이 이 두 유전자의 서로 다른 질환 연관성을 설명할 수 있다는 것을 이 데이터는 시사했다.
그렇다면 오가노이드와 살아있는 뇌, 두 시스템의 결과는 얼마나 일치할까? 일부 유전자들, 특히 BAF 복합체 관련 유전자들은 두 시스템에서 일관되게 중요한 것으로 나타났다. ARID1B는 Li et al.의 오가노이드 스크린에서 BAF 복합체 기능 장애의 대표 주자였고, Shi et al. (2026)의 인 비보 스크린에서 Smarcb1과 Smarcc2 같은 BAF 복합체 성분들이 시상 뉴런에서 시냅스 전달과 흥분성 관련 유전자들을 억제하는 것으로 나타났다. 어떤 시스템을 쓰더라도, BAF 복합체 교란은 뉴런에서 중요한 표현형을 만들어낸다는 것이 일관되게 확인된다. 그러나 차이점도 분명히 존재했다. 오가노이드에서는 세포 운명 결정, 즉 어떤 세포 유형이 생겨나는가에 대한 교란 효과가 두드러진 반면, 살아있는 뇌에서는 이미 운명이 결정된 성숙한 세포의 기능 유지나 생존에 대한 효과가 주로 관찰되었다. 이것은 실험 시스템이 다른 발달 시점을 포착하기 때문이기도 하고, 오가노이드와 실제 뇌 사이의 세포 환경 차이 때문이기도 하다. 두 시스템은 서로를 완전히 대체할 수 없으며, 상호 보완적으로 사용해야 한다는 교훈이 여기에 있다.
References
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Meng, X., Yao, D., & Pașca, S. P. (2023). Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment. Nature, 622(7982), 359-366. doi:10.1038/s41586-023-06564-w
Fleck, J. S., Jansen, S. M. J., Wollny, D., Zenk, F., Seimiya, M., Jain, A., … & Treutlein, B. (2023). Inferring and perturbing cell fate regulomes in human brain organoids. Nature, 621(7978), 361-369. doi:10.1038/s41586-022-05279-8
Shi, T., Korshunova, M., Kim, S., DeTomaso, D., Zheng, X., et al. (2026). Genome-scale functional mapping of the mammalian whole brain with in vivo Perturb-seq. doi:10.64898/2026.03.16.711480
주요 용어 안내
CRISPR 스크리닝: CRISPR 기술을 이용하여 수백~수천 개의 유전자를 체계적으로 교란하고, 각 교란의 효과를 대규모로 분석하는 실험 방법. 오가노이드나 살아있는 뇌에서 수행된다.
유전적 필수성(genetic essentiality): 특정 유전자가 특정 세포 유형의 생존이나 기능에 필수적인 정도. 어떤 유전자는 뇌 전체에서 필수적이고, 어떤 유전자는 특정 세포 유형에서만 필수적이다.